交联染色质免疫沉淀（ChIP）方案
用法说明
ChIP（染色质免疫共沉淀）是一种用于研究蛋白与DNA之间自然状态下相互作用的技术。它依赖于特定抗体与抗原的特异性反应，因此能够真实地反映蛋白因子与基因组DNA在体内的结合情况。目标蛋白与DNA被交联在一起，然后通过声波或酶切将DNA打断成小片段。通过抗体与抗原之间的特异性反应，我们可以沉淀下预测的DNA片段。这个过程特异性地富集了与目标蛋白结合的DNA片段。最后，我们可以从复合物中纯化DNA，并根据PCR或qPCR方案验证DNA。
溶液和试剂
ChIP溶解缓冲液：1% TritonX-100，0.1% NaDOC，0.1% SDS，1mM EDTA（pH8.0），140mM NaCl，50mM Tris-HCl（pH8.0）
RIPA缓冲液：1% NP-40，0.5% NaDOC，0.1% SDS，2mM EDTA（pH8.0），150mM NaCl，50mM Tris-HCl（pH8.0）
低盐洗涤缓冲液：1% TritonX-100，0.1% SDS，2mM EDTA（pH8.0），150mM NaCl，20mM Tris-HCl（pH8.0）
高盐洗涤缓冲液：1% TritonX-100，0.1% SDS，2mM EDTA（pH8.0），500mM NaCl，20mM Tris-HCl（pH8.0）
LiCl缓冲液：0.25M LiCl，1% NP-40，1% NaDOC，1mM EDTA，10mM Tris-HCl（pH8.0）
TE缓冲液：1mM EDTA，10mM Tris-HCl（pH8.0）
洗脱缓冲液：1% SDS，100mM NaHCO3
样品制备
● 交联和裂解-转录因子和辅助因子
细胞在10厘米培养皿中以20毫升培养基进行培养。当细胞密度达到80%至90%时，可用于进行ChIP实验。细胞数量的选择取决于您研究的目标蛋白质。您可以参考以下表格：
| 蛋白质 | 细胞数（用于ChIP反应） | 蛋白靶丰度 |
|---|---|---|
| 组蛋白蛋白质RNA聚合酶II | 104 | 高 |
| 转录因子 | 105-106 | 中等 |
| 辅因子 | 107 或更多 | 低 |
为了获得更好的结果，对于组蛋白蛋白和RNA聚合酶II，我们建议使用超过4×106个细胞，而转录因子或辅因子可能需要更多细胞。我们使用1%的甲醛作为交联剂，将蛋白质与DNA交联在一起。这个过程是时间依赖性的，所以我们需要针对不同的细胞进行优化。交联不足会导致假阴性结果，而过度交联可能会掩盖表位，导致假阳性结果。我们建议将样品交联10分钟。交联反应可以通过甘氨酸来逆转。
1. 将培养皿取出，向20ml培养基中加入550μl的37%甲醛。充分混合，使最终甲醛浓度达到1%。
2. 将培养皿放置在室温下静置10分钟。这个过程是蛋白质和DNA之间的交联反应，时间不宜过长，否则会导致假阳性结果。
3. 加入125mM甘氨酸溶液终止交联反应。轻轻混合溶液。
4. 将培养皿放置在室温下静置5分钟。
5. 去除培养基，用冰冷PBS洗涤细胞3次。
6. 向培养皿中加入含有蛋白酶抑制剂的1ml冰冷PBS，并迅速刮取细胞。
7. 用适量的PBS洗涤培养皿底部2次。将PBS吸入步骤6中的离心管中。
8. 以2500rpm、4℃离心3分钟，收集沉淀物。
9. 向细胞悬浮液中加入适量的ChIP裂解缓冲液（2×107细胞使用1ml），在冰上裂解细胞15分钟。
10. 超声处理细胞，以打断DNA，理想的DNA片段大小为200-1000bp。超声处理的条件因细胞类型和使用的设备而异。对于每种细胞，您需要探索相应的超声处理条件。
11. 以12000rpm、4℃离心10分钟。
● 声处理
超声处理过程也是时间相关的。理想的DNA片段大小为200-1000bp，需要根据不同的细胞系进行优化。
1. 超声处理细胞，打断DNA，理想的DNA片段大小为200-1000bp。超声处理的条件因细胞类型和使用的设备而异。对于每种细胞，您需要探索相应的超声处理条件。
2. 以12000rpm、4℃离心10分钟。将上清液分离到一个新的离心管中。
3. 取50μl上清液进行琼脂糖凝胶分析，以验证超声处理的效果。
● DNA片段的测定
1. 将70μl洗脱缓冲液加入50μl染色质中。
2. 加入4.8μl 5M NaCl和2μl 10mg/ml RNase A，在65℃孵育过夜。目的是去除RNA的干扰。
3. 加入2μl 20mg/ml蛋白酶K，在60℃孵育1小时。目的是打断蛋白与DNA之间的反应，并有助于DNA的纯化。
4. 使用DNA纯化试剂盒富集DNA，或进行苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀法。
5. 使用2%琼脂糖凝胶检测超声处理效果。
免疫沉淀反应
1. 将包含来自1×107细胞的DNA的500μl染色质（用RIPA缓冲液稀释）转移至离心管，并取50μl染色质作为输入组。
2. 在免疫沉淀前，您需要设计四组实验：
- 实验组：将2-5μg特异性初级抗体加入500μl染色质中，并将离心管放置在4℃的旋转混合器上过夜，形成抗原-抗体复合物。
- 输入组：除了免疫沉淀反应外，所有步骤都与实验组相同。
- 阴性对照组：所有步骤与实验组相同，但使用正常兔IgG代替抗体。
- 阳性对照组：所有步骤与实验组相同，但使用组蛋白H3或RNA聚合酶II抗体代替抗体。
3. 在4℃下将50μl磁珠加入复合物溶液中，孵育2-4小时。
4. 将磁珠吸附在磁架上并去除上清液。
洗掉珠子
1. 使用过滤吸头对磁珠进行洗涤:
- 2×1ml 低盐洗涤缓冲液
- 2×1ml 高盐洗涤缓冲液
- 2×1ml LiCl洗涤缓冲液
- 2×1ml TE缓冲液
依次使用上述缓冲液对磁珠进行两次洗涤。每次使用吸头吸液3-8次，并旋转搅拌10分钟。
2. 使用磁架去除洗涤缓冲液并收集沉淀复合物。
反交联
1. 将120μl洗涤缓冲液加入沉淀复合物中，在旋转混合器上以室温慢慢混合15分钟。
2. 重复上述步骤一次。
3. 使用磁架将上清液收集到一个新的管中。
4. 将9.6μl 5M NaCl和2μl 10mg/ml RNase加入所有组中，然后在65℃水浴中过夜以解除交联作用。
5. 加入2μl 20mg/ml蛋白酶K，在60℃孵育1小时。
DNA纯化
您可以根据提取试剂盒的说明书进行DNA提取，或者使用苯酚-氯仿萃取和乙醇沉淀方法进行提取。
