如何选择合适的二抗

1. 一抗的宿主物种是什么?

众所周知，一抗从何而来，而相应的二抗也是一种针对该物种的抗体。换句话说，二抗是直接针对宿主的一抗。因此，你需要一种二抗，这种二抗与一抗的宿主物种不同，以避免物种反应性。例如，如果您的一抗是小鼠来源的单克隆抗体，则二抗被选择为抗小鼠二抗(山羊抗小鼠或兔抗小鼠)。如果一抗是由兔血清制备的兔源性多克隆抗体，则相应的二抗需要选择一种针对兔的二抗。即根据一抗的种类来源，选择相应的针对该物种的二抗。

2. 一抗的类别(同型)和/或亚类别是什么?

二抗除与一抗的种源一致外，还需与一抗的类或亚类相匹配，尤其是与单克隆抗体协同工作时。而多克隆抗体主要是典型的IgG或IgG样类免疫球蛋白，因此相应的二抗是抗IgG抗体。

与多克隆抗体相比，单克隆抗体更为复杂。由于单克隆抗体有不同的类别和亚型，相应的二抗也需要根据这些亚型来选择。它们最常见于小鼠，偶尔见于大鼠、仓鼠或兔子。例如，如果一抗单克隆抗体是小鼠IgM，则所需的二抗应该是抗小鼠IgM。

如果单克隆一抗是小鼠IgG亚类(IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3)中的一种，那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合，也可以选择靶向这一亚类。但如果一抗的亚类不知道，那么你可以选择抗小鼠IgG F(ab)二抗，它具有识别大多数小鼠免疫球蛋白亚类的能力。在这里，我们整理了免疫球蛋白的类别和子类如下:

• 免疫球蛋白类：IgG, IgM, IgA, IgE, IgD
• 人免疫球蛋白亚类：IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1和IgA2
• 小鼠免疫球蛋白亚类：IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3
• 轻链：Kappa, Lambda
• 重链：IgG (γ)， IgM (mu)， IgA (α)， IgD (δ)， IgE (ε)

当你读到这里，你可能会觉得选择一个正确的二级是非常困难的，存在许多类和子类的人类和小鼠IgG(s)。是的，我同意你的观点。如果想获得更准确的实验数据，就应该反复这样做。

注意：这些IgG的一个共同因子是轻链(κ和λ)。换句话说，IgG, IgM, IgA, IgD和IgE都有κ或λ轻链。然而，重链是特定于类的。

3. 二抗的种类是什么?

一般来说，没有证据表明二抗的质量存在物种特异性的差异，也就是说，在一般的实验中，山羊产生的二抗与驴产生的二抗没有太大的区别。因此，宿主物种的选择应基于其他标准。

但在一些特殊的实验中，如双标实验中，如果一抗中的一抗是山羊源的，而另一抗是小鼠源的，则相应的二抗分别对山羊和抗小鼠的二抗具有抗性。二抗不能从山羊或小鼠来源中选择。双标记的两种是耐药的，所以需要选择第三种抗体来源。

4. 我需要预吸附的二抗吗?

预吸附抗体又称交叉吸附抗体，是一种经过处理以消除不需要的免疫球蛋白、抗体片段和/或细胞和组织样本的反应性，从而提高抗体特异性的抗体。建议使用一种二抗，它预先吸附到你正在检测的物种。在这里，我们为你列举了两种情况，当你必须选择一个预吸附的二抗。

选择预吸附抗体，当免疫印迹组织和细胞也有高水平的免疫球蛋白。预吸附的二抗与内源性免疫球蛋白相互作用的可能性较小，从而可能减少非特异性背景。

如果你在同一试验中使用了两种不同的二抗(多重标记)，你要确保任何一种二抗都不能相互识别。

5. 我应该选择什么样的标签?

一般情况下，二抗可以是酶标记(辣根过氧化物酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生物APAAP, PAP)，荧光标记(FITC, Alexa-Fluor, Qdot)或生物素偶联。选择标记的二抗主要取决于特定的实验。

对于western blot和ELISA，最常用的二抗是酶标二抗，而荧光标记二抗通常用于细胞或组织标记实验(细胞免疫化学、组织免疫化学、流式细胞术)。辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的二抗也可用于治疗。

如果要将检测信号放大到更大的程度，可以使用生物素/亲和素检测系统。在一些荧光检测方案中，需要选择不同的荧光标记;而金颗粒标记的二抗则更常用于免疫电镜检查。

6. 我应该使用亲和纯化抗体还是IgG部分?

亲和纯化抗体是通过固相亲和层析从其他抗血清蛋白和非特异性免疫球蛋白中分离出单特异性抗体。近年来，亲和纯化抗体因其特异性强、低背景、灵敏度高、批间一致性好等特点而广泛流行。

然而，使用亲和纯化抗体或IgG部分的优势将取决于预期的结合类型。在某些情况下，纯化过程中丢失的IgG部分也被考虑在内，因为它含有高亲和力的抗体，特别是当感兴趣的抗原量较小时，高亲和力的IgG部分尤为重要。一般来说，IgG组分可用于浊度测定。大多数其他免疫测定应使用亲和纯化抗体。如果你不确定，选择一种经过亲和纯化的第二抗体。

7. 什么时候需要F(ab)或F(ab')2片段抗体?

F(ab')2片段:该抗体由两个Fab片段通过二硫键结合抗原组成。在实验设置中，酶胃蛋白酶在铰链区域下方裂解，因此形成了F(ab')2片段和pFc'片段。这些抗体用于特定情况，例如需要避免携带Fc受体的抗体和细胞。

Fab片段:抗原结合(Fab)片段是抗体上与抗原结合的区域。它由重链和轻链各一个常数域和一个可变域组成。可变结构域包含抗原结合位点，在单体的氨基端包含一组互补决定区。只有一个结合位点并通常用于阻断内源性免疫球蛋白类。在实验条件下，木瓜蛋白酶可用于将免疫球蛋白单体裂解为两个Fab片段和一个Fc片段。

F(ab')2抗体片段用于Fc区可能引起问题的检测系统。淋巴结、脾脏和外周血制剂等样本含有带有Fc受体的细胞(巨噬细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞)，这些细胞可与完整抗体的Fc区结合，导致高本底染色。使用F(ab')2片段确保观察到的任何抗体结合都不是由于Fc受体。