如何选择合适的抗体

1. 特异性的选择

特异性的选择主要需要考虑四个方面：蛋白质的特异性、物种的特异性、实验方法的特异性以及标记的特异性。

1.1 蛋白质的特异性

什么是蛋白质的特异性？一般来说，蛋白质的特异性指的是蛋白质结合位点与特定配体结合的能力。一个蛋白质-配体的例子就是抗体-抗原系统，它们之间的结合活性可以被描述为高度特异。了解了蛋白质的特异性后，理解抗体的特异性将更加容易。每个单个抗体蛋白都能够通过其Y形状抗体蛋白的可变区顶端的独特抗原结合位点，与抗原上的一个唯一表位特异结合。这种特异性能够精确检测目标抗原。

常数区域在一个给定类型的所有抗体中都是相同的，选择抗体时根据检测的蛋白质，需要了解以下细节：

a. 如果重组蛋白并不完整表达，需要确认抗原结合位点是否位于重组蛋白的序列范围内。

b. 对于内源性蛋白质，最好了解它们的剪接和修饰情况。对于具有特殊表型的蛋白质，需要通过比较免疫原序列和感兴趣的蛋白质序列进行序列比对，以检查物种的交叉反应性。

c. 检测磷酸化蛋白质需要确定特定的磷酸化位点。不同的磷酸化位点意味着可能存在不同的机制，不能一概而论。

1.2 物种特异性

同源蛋白在不同物种之间存在更多或更少的变异。

a. 大多数商业抗体是使用源自人类蛋白质序列的重组蛋白或肽段制备的，因此它们可能基于序列同源性与其他物种发生交叉反应。您需要查看抗体数据表中标明的物种反应性。

b. 对于一些稀有物种，很难找到适用的抗体。在这种情况下，您应该通过序列比对选择使用同源序列产生的抗体，但通常制造商不会接受关于质量的投诉。如果您能从供应商处获得免费的抗体样品，将更容易选择到合适的抗体。

1.3 实验方法的特异性

许多实验需要使用抗体。在不同的方法中，由于样品制备和目标蛋白含量的差异，对于表位和抗体效价有不同的要求。

1.4 标记的特异性

常见的实验，如WB和IHC，通常不需要标记的一抗，而是使用标记的二抗。然而，某些基于仪器分析的实验可能会使用标记的一抗，例如流式细胞术（FC）。在这种情况下，需要了解所使用仪器可以检测的荧光光谱，并根据不同的参数要求选择合适的标记。在免疫荧光双标记实验中，应选择和匹配不同的荧光标记。

2. 抗体的选择取决于实验/应用

2.1 如何选择WB抗体?

许多人建议使用单克隆抗体作为WB的一抗。目前，多克隆抗体生产技术与单克隆抗体生产技术一样成熟。因此，许多多克隆抗体在WB中也表现良好。除了一抗和二抗外，WB还涉及到负载控制抗体的使用，这有助于确认整个凝胶中的蛋白质负载是相同的。加载控制通常是在你所研究的细胞类型中高水平表达的蛋白质。最后但并非最不重要的是，无论你做什么实验，建议参考相关文献来选择合适的抗体。

2.2 如何选择适用于IP/ChIP的抗体？

在免疫共沉淀（IP）中，抗体与目标蛋白的自然形式结合。因此，适用于IP的最佳抗体是使用纯化的自然蛋白或纯化的重组蛋白制备的抗体。最好不要使用使用合成肽制备的抗体，因为这种抗体识别的区域可能深藏在目标蛋白的内部。

免疫沉淀（ChIP）与IP之间没有太大区别。唯一的问题是，如果抗体识别的目标蛋白区域与结合到DNA的目标蛋白区域相同，实验可能会失败。

2.3 如何选择适用于IF/IHC的抗体？

在免疫荧光（IF）/免疫组化（IHC）中，有一个重要的步骤叫做固定，用于保留细胞和亚细胞结构。固定会使蛋白质变性和固定，意味着这些蛋白质与其自然形式不同，但也不同于在免疫印迹（WB）中看到的线性结构。因此，对于IF/IHC，首选的抗体是使用纯化的重组蛋白或使用蛋白质表面的合成肽制备的抗体。

2.4 如何选择适用于FC的抗体？

流式细胞术（FC）可以分为活细胞FC和固定细胞FC两种类型。对于活细胞FC，最好选择使用自然蛋白或重组蛋白制备的抗体；对于固定细胞FC，使用的抗体与IF/IHC中使用的抗体相同。在FC中，有直接标记和间接标记两种方法。间接标记相对于直接标记来说准确性较低。因此，在进行FC时，最好选择带有荧光标记的抗体；如果没有针对目标蛋白的标记抗体，则可以选择间接标记，其中需要使用带有荧光染料的二抗。

3. 主抗体和二抗的选择

3.1 如何选择一抗？

a. 确认抗体的名称。全名、缩写、替代名称、亚型等细节都需要考虑。

b. 确认实验/应用的类型。ELISA、WB、IHC、ICC、FACS或其他？一般来说，抗体的产品说明书会列出该抗体在哪些应用中经过验证。如果抗体的产品说明书没有提及特定的应用，这并不意味着该抗体不适用于该应用，只是表示该抗体在该应用中没有经过验证。但一般而言，最好根据产品说明书中列出的验证信息选择合适的抗体。

c. 确认样本的物种。人类、小鼠、大鼠、绵羊、鱼类还是山羊？一般来说，抗体的产品说明书会包含物种反应性的信息。有了这些信息，你可以确定该抗体是否适用于你的实验。

d. 目标蛋白的结构特性。了解目标蛋白的结构特性将有助于你选择合适的抗体。这些结构信息包括目标蛋白的结构域、样本制备过程中蛋白质是否变性、蛋白质构象的变化以及可能影响免疫亲和反应的其他因素。

e. 单克隆抗体和多克隆抗体的选择。市场上以多克隆抗体为主导。与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有更高的特异性但亲和力较低，从而导致相对较低的抗原检测灵敏度。多克隆抗体具有较低的特异性但较高的亲和力，因此其灵敏度更高。使用多克隆抗体可能会增加非特异性染色的风险，可以通过阻断或其他步骤来避免这种情况。

3.2 如何选择二抗?

a. 种类或来源。根据一抗的种类选择二抗。例如，如果在小鼠体内培养一抗，二抗就会对小鼠抗体产生反应。

b. 标签的选择。有不同的标签，如HRP，生物素和荧光素。SP三步法一般采用生物素标记的二抗与SP反应，荧光素染色采用罗丹明、FITC、Cy3等不同荧光素标记的二抗体。

4. 常见问题解答

当您购买抗体时，抗体供应商/制造商通常会提供额外的技术支持，这非常重要。在过去，购买了我们公司Cusabio的抗体的一些客户寻求了技术支持。以下是一些最常见的问题。

4.1 FC抗体与IHC抗体相同吗?

它们不一定是相同的抗体。对于FC，有直接标记和间接标记。对于直接标记，抗体通常是FITC, TRITC或pe标记。如果你碰巧做免疫组化并且想要使用荧光素标记的抗体直接标记，那么你可以使用相同的抗体。如果你想在免疫组化中使用其他标记或间接标记，可能会遇到麻烦，因为荧光素标记可能会影响二抗与一抗的结合。

4.2 为什么我的抗体在WB中表现很好，但在其他实验如IF和IHC中却不起作用?

首先，恭喜你有一个良好的抗体。毕竟，要获得好的抗体并不容易。其次，你的抗体可能是用合成肽产生的。如上所述，你的抗体识别的抗原肽可能恰好隐藏在目标蛋白的中心，所以你的抗体只能识别WB中的线性蛋白。

4.3 如何选择用于免疫组织化学（IHC）的抗体？

首先，需要决定选择单克隆抗体还是多克隆抗体。单克隆抗体和多克隆抗体的区别已经在前面总结过。如果您的实验需要高特异性，单克隆抗体可能是更好的选择。如果阳性信号较弱，可以尝试多克隆抗体。多克隆抗体通常是从兔子中获得的，而单克隆抗体通常是从小鼠中获得的。当然，还有其他动物提供的抗体。

其次，了解主抗体可以与哪些物种反应很重要。这些信息通常在抗体产品说明书中说明。

第三，您应该注意主抗体的来源。例如，当您在人类癌组织中进行IHC检测p53，并使用小鼠产生的抗-p53抗体作为主抗体时，您必须选择抗小鼠的二抗，如山羊抗小鼠抗体和兔抗小鼠抗体。总之，主抗体和二抗应匹配。

最后，抗体产品说明书通常包含抗体适用的应用程序信息。如果说明书指出该抗体不能用于IHC，不要选择它。即使说明书强调该抗体可用于IHC，也有一些情况下该抗体在IHC中效果不佳。自行验证抗体可以帮助您获得成功的实验结果。

4.4 WB次级抗体和IF次级抗体相同吗？

显然不相同！IF次级抗体用于免疫荧光试验，并且标记有FITC、PE或其他能够被紫外光激活的标记物，信号通过荧光显微镜检测。WB次级抗体通常标记有HRP、碱性磷酸酶或其他能与显色底物（如OPD\TMB）反应的分子，结果可以直接用肉眼观察或通过化学发光仪器检测。

4.5 ChIP抗体能在WB中使用吗？

不一定。一般来说，ChIP抗体对纯度、特异性和其他参数有更高的要求。因此，ChIP抗体通常可以在WB中使用。然而，ChIP抗体识别的是构象性抗原表位，而不是线性表位。这种类型的ChIP抗体不能在WB中使用。

4.6 如果抗体产品说明书中没有提及特定的应用程序怎么办？

通常，抗体会在WB、IP、IF和IHC中进行验证。因此，最好不要将抗体用于未在抗体产品说明书中提及的实验。

4.7 ELISA抗体可以用于WB吗？

对于WB，抗体的稀释倍数通常为1:1000；对于IF/IHC，为1:100；对于ELISA，为1:10000。如果一个抗体用于ELISA，通常意味着抗体效价不高。这并不意味着所有用于ELISA的抗体都不能用于WB。如果抗体产品说明书上说明ELISA的稀释倍数为1:1000，那么可以尝试1:100的稀释倍数进行WB实验。