免疫荧光（IF）方案

用途

检测细胞或组织内抗原或半抗原的定位或相对表达。

步骤

1. 样品准备

● 细胞样品的制备

荧光显微镜用于检测荧光信号。为了与该设备兼容，细胞需要在特定的材料上培养。典型的包括玻璃底细胞培养皿和玻璃盖片。细胞密度不宜过大。

● 组织样本的准备

石蜡切片需要脱蜡、水化和抗原修复步骤(参考免疫组化方案),然后与抗体 孵育进行荧光检测。

冷冻切片应先在室温平衡10-20min。 然后，切片用4%甲醛固定10-15min。 用0.2% TritonX-100 渗透20min, 并对细胞样品进行渗透。

2. 固定和渗透作用

样品的固定和渗透是决定实验成功的关键步骤。醛基固定剂(如甲醛、福尔马林和戊二醛)和脱水固定剂(如乙醇)常被用作固定剂。基于醛的固定剂穿过细 胞膜，也可以与细胞蛋白质交联，稳定和硬化样品。与脱水固化剂相比，醛基固化剂效果更好。所以我们建议用4%的甲醛固定细胞。为了使抗体接触到目标蛋白，需要进行渗透作用。洗涤剂常被用作渗透试剂。推荐使用TritonX- 100。它能破坏细胞膜结构，在细胞膜上形成许多小孔。这些小孔为抗体提供了一个通道，使其能够接触到目标蛋白质。与醇类相比，醛类能更好地穿过质膜并固定可溶性蛋白，但某些靶标在醛类交联时会失去抗原性。

(1) 用PBS 冲洗细胞三次。

(2) 用4%甲醛固定细胞10-15min

(3) 用PBS 冲洗细胞三次。

(4) 用1% Triton X-100于室温渗透细胞20分钟。

(5) 用PBS 冲洗细胞三次。

3. 封闭

这一过程是为了减少抗体与其他非特异性蛋白质之间的非特异性结合。我 们常用的阻断液是正常的山羊血清(品种必须与二抗一致)。血清不仅能阻断非特异性结合蛋白，还能阻断细胞或组织中的FC受体。

(1) 用10%正常山羊血清于室温阻断1h。

(2) 擦去多余的液体，保持样品湿润。

4. 抗体孵育

(1) 按照推荐的稀释比例制备一抗溶液，使样品完全覆盖在一抗溶液中。

(2) 一抗4℃孵育过夜。

(3) 用PBS冲洗细胞三次。

(4) 按照推荐稀释比例在暗处制备二抗溶液，使样品完全覆盖在一抗溶液。

(5) 二抗室温孵育1h。

(6) 用PBS冲洗细胞三次。

5. 核染色

DAPI常被用作核试剂，以使细胞结构更清晰。按说明书稀释DAPI试剂，与样品孵育适当时间。染色时间不宜过长。

6. 检测

将样品置于黑暗中，尽快用荧光显微镜或共聚焦激光扫描检测荧光信号。

常见问题

1. 整个细胞片都出现荧光亮点?

(1) 二抗浓度过高，适当降低二抗浓度即可。

(2) 二抗发生沉淀，可以使用过滤或者离心荧光标记二抗。

2. 信号弱或无信号，染色细胞过少?

(1) 目标蛋白在细胞中没有表达；制备细胞裂解液，用 Westerm Bloting 验证目标蛋白在细胞中是否表达；

(2) 表达目标蛋白的细胞过少：标本中使用更多的细胞，试用其他瞬时转染方法，或者使用稳定转染细胞系；

(3) 细胞通透性差：增加通透剂作用的时间或者浓度，或改用其它的通透；

(4) 染色前的固定步骤破坏了抗原表位：改用其他固定方法；

(5) 通透处理使抗原丢失：减少通透剂作用的时间或强度；

(6) 抗体不识别：换用其他抗体；

(7) 一抗稀释度过大：同一样品按最佳的二抗用量作一抗稀释曲线，以确定 更佳的一抗稀释比例；

(8) 二抗选择错误：使用正确的二抗。

3. 只有 DAPI 的蓝光，目的荧光几乎没有或者很弱。

出现这种现象很有可能是抗体比例太低，需提高抗体浓度，可配合提高二抗 浓度；共聚焦的激发荧光强度不够大；二抗是否是对应的种属，比如本来需要山羊抗鼠结果加为山羊抗免。

4. 细胞核周围总是存在有一些蓝色的小点点。

此种情况一般是支原体污染所致，建议用杀支原体药2 周后再检测，或者通 过提高共聚焦背景值来覆盖支原体荧光。

5. 共定位的视野该如何选择?

共定位时，首先判断哪些细胞是转染成功的，比如我过表达了蛋白A,想做蛋白A和蛋白B的共定位关系，则在视野中寻找已成功转染蛋白A的细胞，一般荧光强度会显著高于周边其他细胞，再在这个细胞上观察蛋白B的表达。

6. 视野中细胞之间存在散在的发光点。

有两种情况可造成：

(1) 拍照时PBS量过少引起的非特异性；

(2) PBS未过滤，未溶解的残渣黏附而导致。