天然染色质免疫沉淀（ChIP）方案
用法说明
ChIP（染色质免疫沉淀）是一种用于研究蛋白与DNA在自然状态下的相互作用的技术。它依赖于特定抗体与抗原的特异性反应，因此能够真实地反映蛋白因子和基因组DNA在体内的结合情况。目标蛋白与DNA进行交联，然后通过声波破碎或酶切分解DNA成小片段。通过抗体和抗原之间的特异性反应，我们可以沉淀下预测的DNA片段。这个过程特异性地富集了与目标蛋白结合的DNA片段。最后，我们可以从复合物中纯化DNA，并根据PCR或qPCR的协议验证DNA。
溶液和试剂
反应缓冲液：1mM CaCl2，0.2% Triton X-100或NP-40，50mM Tris-HCl（pH 7.6）
RIPA缓冲液：0.1% SDS，0.1% NaDOC，1% Triton X-100，1mM EDTA，10mM Tris-HCl（pH 7.6）
LiCl缓冲液：0.25M LiCl，0.5% NP-40，0.5% NaDOC，10mM Tris-HCl（pH 7.6）
TE缓冲液：1mM EDTA，10mM Tris-HCl（pH 7.6）
样品制备
交联和裂解-转录因子和辅助因子
细胞在10厘米培养皿中以20毫升培养基进行培养。当细胞密度达到80%至90%时，可用于进行ChIP实验。细胞数量的选择取决于您研究的目标蛋白质。您可以参考以下表格：
| 蛋白质 | 细胞数（用于ChIP反应） | 蛋白靶丰度 |
|---|---|---|
| 组蛋白蛋白质RNA聚合酶II | 104 | 高 |
| 转录因子 | 105-106 | 中等 |
| 辅因子 | 107 或更多 | 低 |
为了确保更好的结果，我们建议使用超过4×106个细胞进行组蛋白和RNA聚合酶II的ChIP实验，而转录因子或辅助因子则需要更多的细胞。
1. 取出培养皿并倒掉培养基。细胞数量约为2×107个。
2. 用冰冷的PBS洗涤细胞3次。
3. 添加1ml PBS，通过刮取的方式收集细胞。
4. 以2500转/分钟的速度，在4℃下离心3分钟，收集细胞。
5. 通过向细胞中加入500μl反应缓冲液（加入新鲜的蛋白酶抑制剂）来重新悬浮细胞，将其在冰上裂解10分钟。
6. 以2500转/分钟的速度，在4℃下离心3分钟，收集细胞。
7. 通过添加1ml反应缓冲液和微量核酸酶，在37℃下反应20分钟。酶解条件应参考微量核酸酶的说明书。处理时间和微量核酸酶的浓度应通过初步实验进行优化。
8. 可以添加5mM EDTA来停止酶解反应。
9. 使用超声波打断DNA，完全破碎。进行6次5秒的超声处理。
10. 以2500转/分钟的速度，在4℃下离心2分钟。将上清液分离到一个新的管中。
11. 您可以取5μl上清液进行琼脂糖凝胶分析，以验证超声处理的效果。
免疫沉淀反应
1. 将包含来自1×107细胞的DNA的500μl细胞裂解液取出放入一个管中。
2. 在免疫沉淀之前，您需要设计四组实验：
- 实验组：将2-5μg特异性抗体加入500μl细胞裂解液中，并将管子放置在4℃旋转混合器中过夜，形成抗原-抗体复合物。
- 输入对照组：除了免疫沉淀反应外，所有步骤与实验组相同。
- 阴性对照组：除了使用正常兔子IgG代替抗体外，所有步骤与实验组相同。
- 阳性对照组：除了使用组蛋白H3或RNA聚合酶II抗体代替抗体外，所有步骤与实验组相同。
3. 将50μl磁珠加入复合溶液中，在4℃下孵育2-4小时。
4. 将磁珠吸附在磁力架上，去除上清液。
洗掉珠子
1. 使用过滤吸头对磁珠进行洗涤:
- 2×1ml RIPA缓冲液
- 2×1ml RIPA缓冲液 + 0.3M NaCl
- 2×1ml LiCl缓冲液
- 2×1ml TE缓冲液 + 0.2% Triton X-100
- 1×1ml TE缓冲液。在旋转混合器上混合1分钟。
依次使用上述缓冲液两次洗涤磁珠。每次用吸头抽吸3-8次，并在旋转混合器上旋转10分钟。
2. 通过磁力架去除洗涤缓冲液并收集沉淀复合物。
3. 将沉淀复合物悬浮在100μl TE缓冲液中。添加3-5μl 10% SDS和5μl 20mg/ml蛋白酶K。在65℃下孵育过夜。
4. 第二天，短暂涡旋混合，并使用磁力架将上清液转移到新的管中。
5. 用100μl TE缓冲液 + 0.5M NaCl洗涤磁珠。将其与步骤4中的上清液结合。
DNA纯化
您可以根据说明书用试剂盒提取DNA。
