免疫组化（IHC/ICC）方案
原理
免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特 异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离 子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定 性及相对定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性，免疫组织化学正是利用了 这一原理。先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半 抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中 的同类的抗原物质。由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助于 组织化学的方法将抗原抗体结合的部位显示出来，以期达到对组织或细胞 中的未知抗原进行定性，定位或定量的研究。
用途
对组织或细胞中的未知抗原进行定性，定位或定量。
步骤（以石蜡切片为例）
1. 脱蜡和水合
去除切片中的石蜡，暴露组织。进一步，恢复组织的水环境，以帮助检测。
(1) 用二甲苯或环保脱蜡剂浸泡切片至少60分钟，使组织脱蜡。在这道工序 之前，最好先加热切片融化石蜡，这样对去除石蜡会更有效。
(2) 将染色架依次置于100%、100%、95%、85%、75%、60%梯度酒精中，分别浸泡5min。
(3) 0.3% TritonX-100用于渗透细胞膜，有助于分子进入靶细胞，5分钟即可。
注意事项：
a. 全程保持切片各部位呈湿润状态，否则会有很高的背景。
b. 二甲苯有毒，可以用组织透明脱蜡剂代替。
c. 脱蜡前可对切片进行加热，以达到更好的脱蜡效果。
d. 通常使用2% APES- 丙酮缓冲液，通过将切片浸泡1min 并在60℃下加热 15 min来防止切片上的组织剥离。
e. 脱蜡的时间因温度和试剂的不同而有所不同。夏天，室温比较高，可以适 当缩短时间。此外，如果脱蜡剂已经使用了一段时间，最好延长使用时间 或更换新的试剂。
2. 清除内源性酶干扰和抗原修复
在固定过程中，甲醛可以与组织中的抗原交联，阻断抗原决定因子。因此，有必要打开抗原与甲醛的交联效应，以提高组织抗原的检出率。有几种方 法可以达到这一点，包括酶修复和热修复。经实验验证，热修复效果优于酶修复。此外，修复缓冲液也会影响抗原的恢复效果。有三种缓冲液的pH 值不同，包括柠檬酸缓冲液(pH 6.0),EDTA缓冲液(pH 8.0)和TE缓冲液(pH 9.0)。 一般pH值越高，修复力越强。内源性酶，包括过氧化物酶和生物素，可与显色底物DAB 和生物素标记的二抗相互作用，导致假阳性结果。所以我们需要去除内源性酶。长期实验证明，用ddH2O或 PBS 或TBS 或甲醇稀释3%H2O2，在10分钟之内可以很好地消除内源酶的影响。
(1) 用3%H2O2去除内源酶干扰5min。
(2) 于pH 值7.4的PBS 中浸泡切片。
(3) 在1L烧杯中准备500ml 柠檬酸钠缓冲液，并放入高压锅中。将带垫圈的 缓冲液在水浴中加热至100℃。然后，将染色架放置在煮熟的缓冲液中。烧杯口用保鲜膜密封，防止水蒸气在加热过程中进入缓冲液。用 1000w 的电源继续加热至高压状态，保持2分钟，然后立即停止加热。
(4) 等到高压锅自然冷却，开盖取出烧杯，自然冷却至室温。
(5) PBS 分3次冲洗5分钟。
3. 封闭
该过程是阻断抗体与来自同一来源的二抗的血清的非特异性结合。用10%非免疫山羊血清阻塞组织，每片100μL,置于湿箱中室温静置30min。
4. 抗体解育
免疫组化实验应选择经验证的一抗。抗体的稀释比和孵育时间应根据实际情况进行优化。建议低温和较长的孵育时间，以确保抗体与抗原更好的结合。
(1) 除去封闭缓冲液。
(2) 将抗体稀释至适当浓度，加入组织中4℃解育过夜。我们推荐0.01μg/ml 作 为工作浓度。
(3) 用PBST 清洗切片3次，每次5 min。
(4) 按说明书稀释二抗至工作浓度，37℃孵育1小时。我们选择生物素标记 抗体作为二抗。
(5) 用PBST 清洗切片3次，每次5 min。
(6) 第三个抗体按说明书稀释至工作浓度，37℃孵育1h。
(7) 用PBST 清洗切片3次，每次5 min。
注意事项：
a. 为寻求最佳抗体孵育浓度，在正式实验前应通过设置梯度稀释进行初步实验。
b. 建议抗体在低温条件下孵育较长的时间，以确保抗体和抗原的充分结合。 c.切片必须轻柔地清洗干净，特别是在孵育不同抗体时。
5. 染色
这个过程中用到不同的检测系统。 一种被标记的一抗直接与底物反应称为 一步染色法。但是很贵。此外，还可以通过标记二抗对目标蛋白进行染色， 放大检测信号，称为两步法。还有一种三步法，标记第三个抗体以获得更好 的检测信号放大。标记基团可以是HRP 或AP。 该基团可以通过与不同底物 反应而着色。DAB 是一种常见的染色底物。以下，我们执行三步法，其中二 抗用生物素标记，第三个抗体偶联HRP。 最后，用苏木精染色细胞核。
(1) 用PBS 中清洗切片2次，每次5 min。
(2) 配制新鲜的DAB, 使用前过滤。
(3) 在组织中加入DAB, 立即在显微镜下观察染色情况。
(4) 当组织有明显染色时，必须及时在PBS 中清洗切片。
(5) 用苏木精染色液染色细胞核，使细胞结构更清晰。
注意事项：
a. DAB 和苏木精使用前应过滤。
b. 使用前DAB 中应加入新鲜的H2O。
c. 在显微镜下观察标记基团与底物的反应，及时终止显色时间，时间不超过10分钟。
6. 检测
(1) 将切片在60℃下加热至干燥，然后加入适量中性香脂密封组织；
(2) 在显微镜下观察染色，在合适的视野下拍照。
常见问题
1. 无染色
(1) 一抗和二抗不匹配，使用针对一抗的二抗(如一抗来自兔，二抗为抗兔 抗体)
(2) 没有足够的一抗与目标蛋白结合，使用低稀释度抗体。延长4℃孵育时 间(如过夜)。
(3) 抗体的天然结构受损，不适用于IHC, 用天然(非变性的)WB 法检测抗 体，确保抗体没被损坏。
(4) 由于储存不当、稀释或反复冻融造成一抗/二抗试剂盒失效，做阳性对 照确认一抗/二抗试剂盒的有效性。
(5) 靶组织中没有目标蛋白，参照抗体供应商的建议做阳性对照。
(6) 组织中没有足够的目标蛋白，应用信号放大操作。
(7) 没有避光保存二抗，避免将二抗处于光照下。
(8) 脱蜡不彻底，延长脱蜡时间，更换二甲苯。
(9) 固定步骤(使用福尔马林和多聚甲醛固定剂)修饰了抗体识别表位，抗 原修复法暴露出抗原表位，缩短固定时间。
(10) 蛋白位于细胞核内(核蛋白),抗体不能穿透核膜,在封闭液和抗体稀 释液中加入通透剂。
(11) PBS 缓冲液被细菌污染后破坏了靶蛋白的磷酸根在抗体PBS 储存液 中加入0.01%叠氮化合物，或使用新鲜无菌的PBS。
2. 高背景
(1) 没有封闭非特异性结合或封闭不充分，延长封闭时间，并考虑更换封闭剂。
建议用10%正常血清封闭切片1小时或1-5% BSA 封闭培养细胞30 分钟。
(2) 一抗浓度过高
滴定法寻找到最佳抗体浓度，或在浓度较低抗体中延长孵育时间(最 好是缓慢而准确地结合)。
(3) 孵育温度过高，4℃孵育切片或细胞
(4) 二抗发生了非特异性结合(被损坏),不加一抗，做二抗对照。
(5) 组织冲洗不彻底，有固定剂残留，所有步骤都要用PBS 充分洗涤。
(6) 存在内源性过氧化物酶活性，用酶抑制剂如抑制碱性磷酸酶的盐酸左旋咪唑 (2mM)，或抑制过氧化物酶的H2O2 (0.3%v/v)。(详见IH 操作手册)。
(7) 固定过度(固定剂用福尔马林和多聚甲醛)导致抗体识别抗原位点被 修饰，改变抗原修复方法，缩短与抗原修复液的孵育时间。
(8) 信号过度放大(信号放大技术),缩短信号放大孵育时间，稀释信号扩 大试剂盒。
(9) 底物过量(酶检测法),缩短底物孵育时间
(10) 染料与PBS 在细胞/组织中相互作用(酶检测法)
用Tris缓冲液冲洗切片后，再与底物孵育。孵育后，Tris缓冲液再次冲洗细胞/切片。
(11) 通透作用破坏膜并除去了膜蛋白，去除缓冲液中的通透剂。
3. 非特异性染色
(1) 一抗/二抗浓度过高，降低抗体浓度和或缩短孵育周期。对比不表达目 标蛋白细胞的信号强度。
(2) 存在内源性过氧化物酶活性，用酶抑制剂如抑制碱性磷酸酶的盐酸左旋咪唑 (2mM)，或抑制过氧化物酶的H2O2 (0.3% v/v)。(详见IHC操作手册)。
(3) 一抗与被染组织同源(如用鼠一抗测鼠组织),加二抗后，二抗会与同源 的所有组织结合，应用与组织非同源的一抗。
(4) 切片/细胞变干，保持切片/细胞湿度，切勿变干。
