免疫沉淀（IP）方案

用途

用于分离和富集含有特定蛋白质的物质。

步骤

1. 样品准备

● 细胞裂解物样品的制备

(1) 以预冷的PBS中悬浮细胞，以2500rpm,4℃ 离心2分钟，收集细胞。

(2) 加入含有蛋白酶抑制剂的预冷的RIRA 缓冲液来悬浮细胞(每107个细胞 加1ml)。

(3) 用适当功率的超声波处理细胞3分钟。

(4) 将缓冲液放在冰上20-30分钟。

(5) 4℃,12000rpm 离心20分钟。将上清液转移到新的管中，通过BCA法测定蛋白浓度。样品可在-80℃长期冷冻保存，但建议使用新鲜的样品。

● 组织样本的制备

(1) 解决动物问题，获得你需要的组织。用冰冷的PBS 缓冲液把血洗掉。

(2) 用液氮研磨组织，然后超声波处理5分钟。然后进行与细胞裂解样品制备相同的过程。

2. 免疫沉淀反应

(1) 取500ul含有0.5-1mg 蛋白质的细胞裂解液于管中。

(2) 加入3-5μg一抗，4℃孵育过夜。

(3) 在溶液中加入50ul磁珠，捕获抗原抗体复合物，4℃2-4h。

(4) 用磁分离架收集抗原-抗体-磁珠复合物。

3. 洗涤和洗脱或热变性

● 洗涤

有两种方法用于洗涤磁珠，酸洗脱或热变性。前者适用于任何大小的蛋白 质，它具有较低的背景。后者比较方便，但G 蛋白或A 蛋白会煮到上清，影响结果。

用一系列洗涤缓冲液清洗抗原-抗体-磁珠复合物，如下所示：

(1)1ml RIPA缓冲液

(2)1ml PBST缓冲液

(3)1mlPBS 缓冲液

每个缓冲液2次，4℃离心2500rpm

● 酸洗脱

(1) 用50ul150mM甘氨酸-盐酸(pH1.5～2.5) 洗脱缓冲液洗脱2次。

(2) 加入2ul Tris-HCl(pH9.4)中和洗脱液。

(3) 加入20ul 6×loading buffer,100℃加热5分钟。

● 热变性

(1) 根据抗原-抗体-磁珠复合物的体积加入loading buffer。

(2) 在100℃下煮沸抗原-抗体-磁珠复合物10分钟。

(3) 将上清液转移到新管中。

4. 检测

用WB 检测了IP反应的结果。参考WB 方案将蛋白质样品装入SDS-PAGE 凝胶中。轻链和重链干扰在检测中很常见。如果目标蛋白的分子量接近55kD, 建议用轻链抗体作为二抗。如果目标蛋白的分子量接近25kD,我们推荐 HRP- 蛋白 A/G 作为二抗。

常见问题

1. 高背景

(1) 去污剂不溶性蛋白有残留
离心后立即去除上清。沉淀中留有不溶性蛋白质，如果再次有悬浮发生，再次离心。

(2) 洗涤不充分
盖上管盖离心前反复颠倒几次。

(3) 使用的抗体特异性不够。
使用亲和纯化的抗体，最好预先吸收。

(4) 使用太多抗体导致非特异性结合
检查推荐抗体用量。尝试使用更少的抗体。

(5) 细胞裂解液中含有太多的细胞或太多蛋白质，导致洗脱液中有很多额 外的(假阳性)蛋白质。
减少细胞数量/裂解液使用。我们推荐使用10-500 μg 细胞裂解液。

(6) 蛋白与抗体非特异性结合
如果有很多非特异结合的蛋白质，可以尝试减少上样珠子的样本数量。您 还可以在开始免疫沉淀实验之前预先孵育珠子和准备好的裂解液(请参阅 实验方案)来预清除裂解液。这应该清除裂解液内任何与珠子非特异结合 的蛋白质。 一些研究人员也使用同种来源和相同免疫球蛋白亚类的无关抗 体来预清除裂解液。

(7) 免疫沉淀实验时抗原降解
确保样品裂解时加入新鲜的蛋白酶抑制剂。

2. 大量抗体被洗脱

太多抗体与目标蛋白质洗脱尝试减少抗体用量。免疫沉淀前将抗体与珠子 交联，并使用温和的甘氨酸缓冲液梯度洗脱将大大减少抗体洗脱量。

3. 没有检测到目的蛋白洗脱

(1) 所用样品中不表达或低水平表达目标蛋白质
检查目标蛋白质的表达谱，以确保它会在您样品的细胞表达。如果有目标 蛋白低水平表达，增加裂解液的使用量。但是，这可能导致增加非特异性结合，所以开始免疫沉淀程序之前最好预先清除裂解液。

(2) 没有足够的抗体捕获目标蛋白
检查抗体的建议使用量。抗体浓度可能需要增加。

(3) 目标蛋白没有从珠子上洗脱
确保您使用的洗脱缓冲液是正确的，并且是洗脱蛋白质所需的正确强度和pH 值。

(4) 抗体没有结合免疫吸附磁珠
确保您使用的珠子与抗体亚型匹配。

(5) 使用的裂解液不正确
检查说明书，看看抗体是否能检测变性蛋白质或天然蛋白质，并确保使用 正确的裂解液。