流式细胞术（FC）方案

用途

通过对细胞的特性进行分析和分类，可以更好地理解细胞的功能和疾病的发生机制。

步骤

1. 样品准备

● 细胞样品的制备

(1) 对于悬浮细胞，以1000rmp 离心收集细胞；对于贴壁细胞，用胰蛋白酶消化细胞，并1000rmp 离心收集贴壁细胞。细胞密度需达到1*106。

(2) 用预冷的PBS 冲洗细胞3次；

● 组织样品的制备

(1) 通过胰酶或胶原酶剪切组织和消化组织肿块。

(2) 在显微镜下观察单个分散细胞并终止消化。胰酶通常用于消化间质较 少的组织，而胶原酶则用于有胶原结构的组织。 一般胰酶作用时间为 20-60min, 而胶原酶作用时间为4-48h。

2. 固定和渗透作用

样品的固定和渗透过程是决定实验成功与否的关键。交联剂(如4%甲醛、 10%福尔马林和戊二醛)和变性剂(如70%乙醇和90%乙醇)常被用作固定剂。交联试剂与细胞蛋白交联，变性试剂与膜反应并破膜。因此，如果使用变性试剂进行固定，则不需要对细胞内蛋白进行渗透标记。但必须将0.2% TritonX-100 交联试剂固定在标记的细胞内蛋白上进行渗透。如果目标蛋白是膜蛋白，则不需要渗透。

(1)70%乙醇4℃固定12h(-20℃ 保存1个月)或4%甲醛室温固定15min, 0.2% TritonX-100渗透5min(4℃ 保存1周)。如果目标蛋白位于膜上，则 可以忽略其固定。对于细胞内蛋白质，需要固定。

(2)1000rpm 离心，PBS 洗三次。

3. 封闭

这一过程是为了减少抗体与其他非特异性蛋白质之间的非特异性结合。常用10%正常山羊血清作为阻断液(品种必须与二抗一致)。

4. 抗体孵育

(1) 根据推荐的稀释比例制备一抗溶液。

(2) 一抗4℃孵育过夜。当用到正常兔或小鼠 |gG 时，我们需要设置阴性对照。

(3) 用PBS 冲洗细胞三次。

(4) 在暗处按照推荐的稀释比例配制二抗溶液。

(5) 二抗4℃孵育30min。

(6) 用PBS 冲洗细胞三次。

(7) 用500 μl PBS重悬检测。

5. 检测

将样品置于黑暗中，尽快用流式细胞仪检测荧光信号。

常见问题

1. 怎么选择合适的对照?

(1) 同型对照：使用同型抗体做平行实验，主要目的是消除抗体与样本的非特异性结合。

(2) 阴性细胞对照：使用已知的不表达目标抗原的细胞做平行实验，主要目的是消除抗体的非特异性结合。

(3) 二抗对照：第二抗体多为荧光标记的多抗，非特异性结合一般较高，可能造成基础荧光值偏高，设立二抗对照平行实验的主要目的是消除二抗的非特异性荧光着色。

(4) 阳性对照： 一般会使用已知的高表达目标抗原的细胞做平行实验，主要目的是排除实验中实验方法、试剂、操作等实验的影响因素。

(5) 空白对照：不进行任何标记的细胞，主要目的是用于测定基础荧光信号 表达值。

2. 收集的细胞通过流式仪检测时， 一般多少的细胞量合适?

进行流式检测时，至少需要记录5000个活细胞， 一般调整细胞密度至 1*10'/100ul 进行流式检测。

3. FCM 检测过程中如何设门(gating)?

一般根据散射光进行设门，即我们通常所说的前散(forward scatter, FSC) 和侧散(side scatter, SSC)来设门。FSC 的大小与细胞的直径成正相关，不 同的细胞，细胞越大，其FSC 越大；反之越小。SSC 的大小与细胞内颗粒结构的质量成正相关，不同的细胞，细胞内颗粒结构越复杂，质量越大，其SSC 越大；反之越小。

4. FCM 检测过程中如何调节补偿?

在FCM检测过程中，如果存在多色，则必须进行荧光补偿调节。调节补偿首先要知道双阴性细胞的情况，其次，必须要用单阳和双阴性细胞。只有在有阴性细胞作为参照的情况下，才能既不会过多又不会过少地调节补偿。

5. FCM 检测时，每次实验的细胞数一定要相同吗?

FCM 检测时，若不进行细胞计数而凭感觉随意进行实验会直接影响实验结 果。当细胞量多而抗体量不变或细胞量不变而抗体量减少，那么荧光抗体平均分布到每个阳性细胞上的量就会相对减少。由此可见，不同的细胞量会影响最终的实验结果。因此，在准备样本时，必须进行细胞计数，使每个分组及每次实验的细胞数保持一致。

6. FCM 检测时，如果存在多色分析，应该如何进行配色呢?

在FCM 检测过程中，如果存在多色分析，虽然可以通过荧光补偿来消除荧光光谱重叠的影响。但调节补偿过大在一定程度上仍然会影响测值的准确性，因此，我们一般建议尽量选择荧光光谱重叠少的荧光抗体组合。