如何表达具有生物活性的蛋白质？
日期：2024-01-26 10:25:19
蛋白质生产--生产特定蛋白质的过程--已成为生物和生物医学科学中一项极其重要的生物技术。在大多数情况下，相关蛋白质在体内具有某种形式的生物活性。根据所生产蛋白质的用途，我们可能会对其生物活性提出不同的要求。但如何才能确保生产的蛋白质具有生物活性呢？本文将重点讨论这个问题，并提供一些解决方案。
首先，需要选择合适的表达系统。
经过多年的发展，已经出现了多种表达系统，通常可分为细胞表达系统和无细胞表达系统。基于细胞的系统可分为细菌系统（包括大肠杆菌、棒状杆菌和荧光假单胞菌）和真核系统（包括酵母（Saccharomyces cerevisiae、Pichia Pastoris）、丝状真菌、杆状病毒感染细胞、非溶解性昆虫细胞表达、利什曼菌和哺乳动物系统）。从这么多不同的表达系统中选择一种合适的系统有些困难，因为不同的表达系统可能有不同的特点。例如，大肠杆菌是一种原核生物，缺乏糖基化修饰等翻译后修饰机制，因此通常不适合表达复杂的真核蛋白质。
请访问此处阅读表格，进一步了解五种常用表达系统的优势和应用。它将帮助您选择合适的表达系统。
其次，需要选择合适的载体。
载体是一种 DNA 分子，可帮助将外来遗传物质输送到另一个细胞中，并在其中复制和/或表达。克隆载体是一种有用的方法，可以产生许多感兴趣基因的拷贝。表达载体会影响基因在目标生物体内转化为 mRNA 和蛋白质的实际表达。在质粒、病毒载体、cosmids 和人工染色体这四种主要载体中，质粒最常用。有一系列可用的质粒载体，但如何选择最佳载体呢？影响载体选择的因素有很多，如插入大小、拷贝数、不相容性、可选择标记、克隆位点和专门的载体功能等。以下是常用载体表。
表1 j9九游会登录入口首页生物常用载体
在选择矢量时，您最好考虑这些因素：
① 插入片段的大小
这里唯一需要考虑的是你要克隆的是大DNA片段还是小DNA片段。为了操作方便，载体必须是相对较小的分子。过大的载体可能会影响复制并导致稳定性问题。通常，质粒可以处理长达 15 kb 的插入片段。但也有一些特殊的质粒可以处理更大的插入物。
② 可选择标记
需要选择性标记。标记可用于识别阳性转化子。可选择标记主要有两类：抗药性标记（包含一种能使特定抗生素失活的酶的编码基因）和辅助营养标记（能使带有标记的细胞在没有培养基中必需营养物质的情况下存活）。
③ 限制位点
必须有多个方便的限制性位点，用于插入要克隆的 DNA。
④ 拷贝数
一般来说，高拷贝数的质粒载体更好。但在某些情况下，需要低拷贝载体，因为高拷贝质粒可能会导致毒性等问题。
第三，需要选择适当的纯化方法。
对于某些应用，粗提取物就足够了。但对于其他用途，则需要高纯度。要生产出高纯度的蛋白质，就必须对所生产的蛋白质进行纯化。蛋白质纯化是指从细胞、组织或整个生物体中分离出一种或多种蛋白质的过程。目前已开发出多种纯化策略，如尺寸排阻色谱法（SEC）、基于电荷或疏水性的分离法、亲和色谱法（AC）和高效液相色谱法（HPLC）。
第四，验证实验很重要。
要确认所生产蛋白质的生物活性，通常需要进行验证实验。应测量折叠、修饰和活性。重组蛋白的生物活性通常是通过酶联免疫吸附试验等生物检测方法来测定的。酶联免疫吸附试验（ELISA）和西部印迹法（WB）是检测复杂混合物中特定蛋白质的两种最有效的方法。
ELISA 是一种利用抗体和颜色变化来识别具有抗原特性的物质（如蛋白质、激素、细菌抗原和抗体）的方法。ELISA 检测通常具有高度灵敏性和特异性。
WB 是一种根据蛋白质与特定抗体结合的能力来识别和定位蛋白质的技术。它可以提供有关蛋白质大小的信息（与以 kDa 为单位的大小标记或梯子进行比较），还可以提供有关蛋白质表达的信息（与对照组进行比较，如未经处理的样本或其他细胞类型或组织）。
总之，表达具有生物活性的重组蛋白是一个复杂的过程，需要考虑很多方面。作为生产商，Cusabio 可提供蛋白质表达服务，帮助您开展研究。有关j9九游会登录入口首页生物蛋白服务的更多详情，请访问 /protein_service/。
首先，需要选择合适的表达系统。
经过多年的发展，已经出现了多种表达系统，通常可分为细胞表达系统和无细胞表达系统。基于细胞的系统可分为细菌系统（包括大肠杆菌、棒状杆菌和荧光假单胞菌）和真核系统（包括酵母（Saccharomyces cerevisiae、Pichia Pastoris）、丝状真菌、杆状病毒感染细胞、非溶解性昆虫细胞表达、利什曼菌和哺乳动物系统）。从这么多不同的表达系统中选择一种合适的系统有些困难，因为不同的表达系统可能有不同的特点。例如，大肠杆菌是一种原核生物，缺乏糖基化修饰等翻译后修饰机制，因此通常不适合表达复杂的真核蛋白质。
请访问此处阅读表格，进一步了解五种常用表达系统的优势和应用。它将帮助您选择合适的表达系统。
其次，需要选择合适的载体。
载体是一种 DNA 分子，可帮助将外来遗传物质输送到另一个细胞中，并在其中复制和/或表达。克隆载体是一种有用的方法，可以产生许多感兴趣基因的拷贝。表达载体会影响基因在目标生物体内转化为 mRNA 和蛋白质的实际表达。在质粒、病毒载体、cosmids 和人工染色体这四种主要载体中，质粒最常用。有一系列可用的质粒载体，但如何选择最佳载体呢？影响载体选择的因素有很多，如插入大小、拷贝数、不相容性、可选择标记、克隆位点和专门的载体功能等。以下是常用载体表。
表1 j9九游会登录入口首页生物常用载体
| 表达系统 | 载体 | 标签 |
| 大肠杆菌表达系统 | pGEX-6p-1 | N-terminal GST-tagged |
| pGEX-4T-1 | N-terminal GST-tagged | |
| pGEX-4T-2 | N-terminal GST-tagged | |
| pET21a(+) | C-terminal 6xHis-tagged | |
| pET21b(+) | C-terminal 6xHis-tagged | |
| pET22b(+) | C-terminal 6xHis-tagged | |
| pET-23b(+) | C-terminal 6xHis-tagged | |
| pET-26b(+) | C-terminal 6xHis-tagged | |
| pET28a(+) | N-terminal 6xHis-tagged and C-terminal 6xHis-tagged | |
| pET-29a(+) | C-terminal 6xHis-tagged | |
| pET30a(+) | N-terminal 6xHis-tagged and C-terminal 6xHis-tagged | |
| pET32a(+) | N-terminal 6xHis-Trx-tagged and C-terminal 6xHis-tagged | |
| pET-43.1a(+) | N-terminal 6xHis-NusA-tagged and C-terminal 6xHis-tagged | |
| pMal-c2X | N-terminal MBP-tagged | |
| pColdIII | NO-tagged | |
| pBV220 | NO-tagged | |
| pACYCDuet-1 | N-terminal 6xHis-tagged | |
| pETDuet-1 | N-terminal 6xHis-tagged | |
| 酵母表达系统 | pPIC9K | NO-tagged |
| pPIC3.5K | NO-tagged | |
| pPICZα A | C-terminal Myc-tagged and C-terminal 6xHis-tagged | |
| pGAPZα A | C-terminal Myc-tagged and C-terminal 6xHis-tagged | |
| pPICZ A | C-terminal Myc-tagged and C-terminal 6xHis-tagged | |
| pPinkα-HC | NO-tagged | |
| pPinkα-LC | NO-tagged | |
| 哺乳动物细胞表达系统 | pCMV6-Entry | C-terminal Flag-tagged |
| pSecTag2A | C-terminal 6xHis-tagged | |
| pTT5 | NO-tagged | |
| 昆虫-杆状病毒表达系统 | pFastBac 1 | NO-tagged |
| pFastBac HTB | N-terminal 6xHis-tagged | |
| pFastBac Dual | NO-tagged | |
| 无细胞表达系统 | pET21a | N-10xHis tag |
| pET28a-sumo | N-10xHis tag-sumo tag | |
| pET23b | C-6xHis tag |
在选择矢量时，您最好考虑这些因素：
① 插入片段的大小
这里唯一需要考虑的是你要克隆的是大DNA片段还是小DNA片段。为了操作方便，载体必须是相对较小的分子。过大的载体可能会影响复制并导致稳定性问题。通常，质粒可以处理长达 15 kb 的插入片段。但也有一些特殊的质粒可以处理更大的插入物。
② 可选择标记
需要选择性标记。标记可用于识别阳性转化子。可选择标记主要有两类：抗药性标记（包含一种能使特定抗生素失活的酶的编码基因）和辅助营养标记（能使带有标记的细胞在没有培养基中必需营养物质的情况下存活）。
③ 限制位点
必须有多个方便的限制性位点，用于插入要克隆的 DNA。
④ 拷贝数
一般来说，高拷贝数的质粒载体更好。但在某些情况下，需要低拷贝载体，因为高拷贝质粒可能会导致毒性等问题。
第三，需要选择适当的纯化方法。
对于某些应用，粗提取物就足够了。但对于其他用途，则需要高纯度。要生产出高纯度的蛋白质，就必须对所生产的蛋白质进行纯化。蛋白质纯化是指从细胞、组织或整个生物体中分离出一种或多种蛋白质的过程。目前已开发出多种纯化策略，如尺寸排阻色谱法（SEC）、基于电荷或疏水性的分离法、亲和色谱法（AC）和高效液相色谱法（HPLC）。
第四，验证实验很重要。
要确认所生产蛋白质的生物活性，通常需要进行验证实验。应测量折叠、修饰和活性。重组蛋白的生物活性通常是通过酶联免疫吸附试验等生物检测方法来测定的。酶联免疫吸附试验（ELISA）和西部印迹法（WB）是检测复杂混合物中特定蛋白质的两种最有效的方法。
ELISA 是一种利用抗体和颜色变化来识别具有抗原特性的物质（如蛋白质、激素、细菌抗原和抗体）的方法。ELISA 检测通常具有高度灵敏性和特异性。
WB 是一种根据蛋白质与特定抗体结合的能力来识别和定位蛋白质的技术。它可以提供有关蛋白质大小的信息（与以 kDa 为单位的大小标记或梯子进行比较），还可以提供有关蛋白质表达的信息（与对照组进行比较，如未经处理的样本或其他细胞类型或组织）。
总之，表达具有生物活性的重组蛋白是一个复杂的过程，需要考虑很多方面。作为生产商，Cusabio 可提供蛋白质表达服务，帮助您开展研究。有关j9九游会登录入口首页生物蛋白服务的更多详情，请访问 /protein_service/。
上一篇： 如何选择合适的表达载体？
下一篇： 重组蛋白的应用前景
