如何选择合适的表达载体？
日期：2024-01-26 10:23:07
在生物医学研究和许多其他领域，对重组蛋白的需求日益增长。要生产重组蛋白质，需要将蛋白质编码序列克隆到合适的表达载体中，然后转化到宿主细胞中。那么，表达载体究竟是什么呢？
简单地说，表达载体是一种 DNA 分子，它携带特定基因进入宿主细胞，并利用细胞的蛋白质合成机制来生产基因编码的蛋白质。表达载体允许外来基因在宿主细胞中高水平表达，经过多年的发展，表达载体已成为一种成熟和流行的生物技术。
由于其功能，表达载体必须包含基因表达所必需的元素。众所周知的元素包括强启动子或正常启动子、正确的翻译启动序列（如核糖体结合位点（RBS）和启动密码子）、终止密码子和转录终止序列。此外，为了便于蛋白质生产后的纯化，表达载体通常带有纯化标签，将其添加到所需的蛋白质序列中。最后，有些表达载体还带有一些特殊的元素，例如对转化或转染至关重要的元素。
说到表达载体，就不得不提到克隆载体。从本质上讲，表达载体和克隆载体都是独立于染色体的人工构建的环状 DNA 序列。通常，表达载体比克隆载体更复杂。克隆载体是指一种 DNA 分子，它能将外来 DNA 带入宿主细胞，在细胞中复制并产生目标基因的多个拷贝。克隆载体包含自我复制的关键元件，但不携带蛋白质表达调控元件。相比之下，表达载体则同时包含这两种元素。
目前，有多种蛋白质表达系统可供选择，如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞。因此，有许多不同的表达载体可用于不同的表达系统。最常见的表达载体是质粒和病毒。决定使用哪种载体取决于表达系统和许多其他因素。合适的表达载体有助于目标蛋白质的成功表达，必要时还有助于蛋白质的纯化。
在选择表达载体时，最好牢记以下几点：
1. 表达系统
你需要选择一种表达系统专用的表达载体。在选择表达载体之前，你应该决定用哪种系统来表达你感兴趣的蛋白质。
2. 纯化标签
如果想在表达后纯化蛋白质，表达载体可能会包含纯化标签，如 His、Myc、FLAG 等。无论如何，是否需要 C 端或 N 端标签取决于实验的具体需要。
3. 目标蛋白的应用
根据目标蛋白的下游应用，表达载体可能含有其他标签和融合蛋白。有时，特定的标签有助于研究目标蛋白的功能和蛋白与蛋白之间的相互作用。如果您想进一步了解目标蛋白的功能，标签和融合蛋白是有用的工具，可以让您进行 Western 印迹、免疫沉淀、pull-down 分析（体外蛋白结合分析）或其他实验。
4. 启动子的强度
启动子是 DNA 分子上与 RNA 聚合酶特异性结合并形成转录起始复合物的区域，转录起始复合物可启动下游基因的转录。启动子就像 "开关 "一样，决定基因的活性，控制基因表达的启动和程度。因此，启动子是构建表达载体的必要条件。
在某些情况下，需要强启动子，而在另一些情况下，则需要普通启动子。例如，在酵母中，TEF1 是强组成型启动子，ADH1 是中等强度的组成型启动子，STE1 是弱组成型启动子。适当的启动子强度足以让产物在宿主细胞内大量积累，并能最大限度地减少对细胞生长的任何不利影响，如毒性。
5. 可选择标记
可选择标记是一种基因，它能赋予含有目标基因（重组载体）的宿主细胞一种适合人工选择的性状。简而言之，可选择标记基因有助于识别和筛选阳性转化子（接受重组载体的细胞）。可选择标记的选择取决于你使用的宿主细胞类型。可选择标记通常是抗生素抗性基因。例如，β-内酰胺酶赋予细菌宿主氨苄西林抗性。
6. 载体大小
这里唯一需要考虑的是，你是在处理大的 DNA 片段还是小的 DNA 片段。为了操作方便，载体必须是相对较小的分子。过大的载体可能会影响复制并导致稳定性问题。通常，质粒可以处理长达 15 kb 的插入片段。但也有一些特殊的质粒可以处理更大的插入物。
任何蛋白质表达系统的最终目标都是生产出高质高量的重组蛋白质。表达载体有助于将外来遗传物质导入宿主细胞，使目的基因在宿主细胞中表达，并促进目的蛋白质的鉴定和纯化。表达载体对重组蛋白的生产起着决定性作用，因此选择理想的表达载体意义重大。
简单地说，表达载体是一种 DNA 分子，它携带特定基因进入宿主细胞，并利用细胞的蛋白质合成机制来生产基因编码的蛋白质。表达载体允许外来基因在宿主细胞中高水平表达，经过多年的发展，表达载体已成为一种成熟和流行的生物技术。
由于其功能，表达载体必须包含基因表达所必需的元素。众所周知的元素包括强启动子或正常启动子、正确的翻译启动序列（如核糖体结合位点（RBS）和启动密码子）、终止密码子和转录终止序列。此外，为了便于蛋白质生产后的纯化，表达载体通常带有纯化标签，将其添加到所需的蛋白质序列中。最后，有些表达载体还带有一些特殊的元素，例如对转化或转染至关重要的元素。
说到表达载体，就不得不提到克隆载体。从本质上讲，表达载体和克隆载体都是独立于染色体的人工构建的环状 DNA 序列。通常，表达载体比克隆载体更复杂。克隆载体是指一种 DNA 分子，它能将外来 DNA 带入宿主细胞，在细胞中复制并产生目标基因的多个拷贝。克隆载体包含自我复制的关键元件，但不携带蛋白质表达调控元件。相比之下，表达载体则同时包含这两种元素。
目前，有多种蛋白质表达系统可供选择，如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞。因此，有许多不同的表达载体可用于不同的表达系统。最常见的表达载体是质粒和病毒。决定使用哪种载体取决于表达系统和许多其他因素。合适的表达载体有助于目标蛋白质的成功表达，必要时还有助于蛋白质的纯化。
在选择表达载体时，最好牢记以下几点：
1. 表达系统
你需要选择一种表达系统专用的表达载体。在选择表达载体之前，你应该决定用哪种系统来表达你感兴趣的蛋白质。
图 1 用于大肠杆菌表达系统的表达载体 pET22b-JT
图 2 用于酵母表达系统的表达载体 pPic9k-JT
2. 纯化标签
如果想在表达后纯化蛋白质，表达载体可能会包含纯化标签，如 His、Myc、FLAG 等。无论如何，是否需要 C 端或 N 端标签取决于实验的具体需要。
3. 目标蛋白的应用
根据目标蛋白的下游应用，表达载体可能含有其他标签和融合蛋白。有时，特定的标签有助于研究目标蛋白的功能和蛋白与蛋白之间的相互作用。如果您想进一步了解目标蛋白的功能，标签和融合蛋白是有用的工具，可以让您进行 Western 印迹、免疫沉淀、pull-down 分析（体外蛋白结合分析）或其他实验。
4. 启动子的强度
启动子是 DNA 分子上与 RNA 聚合酶特异性结合并形成转录起始复合物的区域，转录起始复合物可启动下游基因的转录。启动子就像 "开关 "一样，决定基因的活性，控制基因表达的启动和程度。因此，启动子是构建表达载体的必要条件。
在某些情况下，需要强启动子，而在另一些情况下，则需要普通启动子。例如，在酵母中，TEF1 是强组成型启动子，ADH1 是中等强度的组成型启动子，STE1 是弱组成型启动子。适当的启动子强度足以让产物在宿主细胞内大量积累，并能最大限度地减少对细胞生长的任何不利影响，如毒性。
5. 可选择标记
可选择标记是一种基因，它能赋予含有目标基因（重组载体）的宿主细胞一种适合人工选择的性状。简而言之，可选择标记基因有助于识别和筛选阳性转化子（接受重组载体的细胞）。可选择标记的选择取决于你使用的宿主细胞类型。可选择标记通常是抗生素抗性基因。例如，β-内酰胺酶赋予细菌宿主氨苄西林抗性。
6. 载体大小
这里唯一需要考虑的是，你是在处理大的 DNA 片段还是小的 DNA 片段。为了操作方便，载体必须是相对较小的分子。过大的载体可能会影响复制并导致稳定性问题。通常，质粒可以处理长达 15 kb 的插入片段。但也有一些特殊的质粒可以处理更大的插入物。
任何蛋白质表达系统的最终目标都是生产出高质高量的重组蛋白质。表达载体有助于将外来遗传物质导入宿主细胞，使目的基因在宿主细胞中表达，并促进目的蛋白质的鉴定和纯化。表达载体对重组蛋白的生产起着决定性作用，因此选择理想的表达载体意义重大。
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