文献解读│CUSABIO产品荣登Nature Medicine：溃疡性结肠炎中结肠CD8 + T细胞的单细胞图谱

日期：2020-09-17 11:29:59

研究背景及目的

结肠内抗原接触的淋巴细胞（如组织驻留记忆CD8+T细胞）可对重复的抗原暴露迅速做出反应。但是，这些CD8+T细胞的细胞表型及其驱动免疫调节和炎症的机制仍不清楚。用单细胞转录组学与T细胞受体库分析和质谱分析技术，研究人员绘制了健康和溃疡性结肠炎（UC）中人结肠CD8+ T细胞图谱，确定健康和UC中的结肠CD8+ T细胞表型，定义不同细胞亚群之间的克隆关系，表征UC中表达IL-26的功能缺陷的终末分化CD8+ T细胞。

结论

CD8+ T细胞组成存在广泛的异质性，包括扩增的效应子和“后效应子”终末分化的CD8+ T细胞。UC相关的CD8+效应细胞可以触发肠道损伤并产生肿瘤坏死因子TNF-α，而后效应细胞的先天特征，可能有助于后效应细胞获得调节功能来减轻过度的炎症反应。在急性炎症反应中IL26具有保护作用。

结果

1.结肠CD8+ T细胞具有高度异质性，UC患者的结肠CD8+ T细胞组成存在结构性变化，UC改变CD8+细胞与上皮细胞的交互应答

利用单细胞测序比较健康志愿者及UC结肠CD8+ T细胞转录组谱，利用UMAP算法将CD8+ T细胞分为14个细胞亚群。GO富集和基因表达丰度分析显示CD8+CD4+亚群具有IL-17通路活性，而IEL和IL26+细胞具有NK通路活性，说明结肠CD8+ T细胞具有广泛异质性。与健康细胞相比，UC结肠CD8+ T细胞中，TRM细胞比例显著减少，GZMK+效应细胞及IL26+细胞比例显著增加。此外，UC中 CD4+CD8+FOXP3+亚群增多，先天TYROBP+ IEL亚群减少，扩增的TYROBP- IEL亚群诱导增多。多数差异基因只存在于一种亚群中，有34个基因在四个以上的亚群中差异表达，这些基因包括在TRM、效应细胞和IEL细胞中下调表达的SPINK2、FOS、CD160和上调表达的TNFRSF9和CTLA4，反映出炎症性肠病（IBD）形成过程中效应细胞具有不同的通路活性。利用转录谱数据进行结肠内IBD遗传易感位点分析显示，UC相关位点的GWAS基因在14个亚群中高度富集，富集程度最高的是TYROBP- IEL和IL26+细胞。

依据差异表达的受体和配体对，研究人员在UC中共鉴定到1716个交互作用的改变。UC结肠细胞中HLA-E在多个上皮细胞亚群中上调，对应的配体在CD8+ T细胞中上调。谱系特异性相互作用包括IL18-IL18R1/IL18RAP和TNF-TNFRSF1A信号分子在吸收细胞和CD8+细胞亚群中线性表达。虽然IL-26在所有组织都表达且与炎症反应程度正相关，IL-26受体IL10RB/IL20RA在上皮细胞、间叶细胞、免疫细胞中均表达较低，说明IL-26在UC中的高表达并不是由其受体造成的。

2.转录调控网络主导UC结肠CD8+细胞的可塑性，TCR profiling揭示不同CD8+细胞亚群之间的联系

基因共表达分析共鉴定到273个转录因子活性相关的基因表达模块。EGR1和EGR2所在的一类基因模块，它们的活性处于TRM向GZMK+效应细胞转换的区域，与炎症因子IFNG、TNF和早期反应转录因子共表达，暗示CD8+ T结肠细胞中，分泌EGR的T细胞能迅速被激活并对大多数致病性TNF做出反应的机制。

UC中富集的GZMK+效应细胞和IL26+细胞具有T细胞耗竭的特征，标志着CD8+ T细胞的肿瘤浸润。这种现象表征为共抑制分子HAVCR2、LAYN、ENTPD1、CTLA4、PDCD1和转录因子TOX和EOMES一致性表达，说明UC中IL26+ CD8+细胞具有慢性激活的特性。

仿时间分析将时间共变基因分为早期、中期/中晚期、晚期表达基因。Na?ve细胞和早期中央记忆T细胞的标记分子（如CCR7）早期表达，共抑制受体（HAVCR2，CTLA4）较晚表达。TCR profiling分析揭示，UC中，未扩增的细胞在仿时间轨迹的起点富集，而大部分扩增的T细胞克隆在仿时间轨迹的终点富集。

3.UC中获得性IL26+细胞显示先天性特征

单细胞谱鉴定到包括MAIT细胞和γδ IELs在内的先天CD8+淋巴细胞簇。虽然MAIT细胞几乎没有异质性，但在UC中，它们活化程序与常规CD8 +细胞类似，包括早期反应基因EGR1和EGR2与TNF和IFNG的共表达，以及以共抑制分子和共刺激分子表达为表征的细胞状态转换。Vδ1 γδ细胞在CD8+ IEL亚群中占有很高比例，但TCR-αβ细胞也大量表达先天免疫细胞标志分子，例如杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）（如KIR2DL4和KIR2DL2），NK细胞受体（如NCR1）和FCER1G。研究人员发现MKI67+细胞表达了部分以上基因，说明UC中IEL亚群正在获得增殖活性。通过结肠上皮细胞scRNA-seq研究捕获的T细胞种群富集有IEL细胞，研究人员对先天性IEL细胞进行了分析，发现这些细胞大部分是CD8+细胞，仅存在少量CD4+细胞。基于TYROBP的表达将IEL细胞分为自然型和诱导型IEL细胞，UC中观察到IEL细胞存在向诱导型转变的偏好。研究人员还发现在UC中增多的获得性CD8+ IL26+细胞也显示出不同于IEL转录谱的先天性特征，IL26+细胞缺少KLRC2和IEL特异性KIRs标记分子，确表达谱系阴性先天性淋巴细胞2型ILC3的标记分子和转录因子。这些结果表明CD8+ IL26+细胞虽然谱系阳性确具有杂合型Tc17和2型ILC3细胞的特性。

4.多组学分析证实UC中CD8+ T细胞异质性和重塑

研究人员利用CITE-seq结合cell hashing技术证实scRNA-seq中CD8+ T细胞亚群分类的可靠性，证实了不同亚群之间组织驻留与迁移偏好的差异，并利用ELISA证实IL-26蛋白在UC结肠CD8+ T细胞中上调表达。

5.多维度分析UC中CD8+细胞亚群功能

利用质谱流式细胞技术，研究人员将39个标记分子整合到scRNA-seq的细胞分类中，将CD8+ T细胞细分为19个亚群。体外细胞激活实验证实CD8+ T细胞活化后，表达TNF-α和IFN-γ的CD103+ TRM细胞亚群在健康和UC结肠细胞中均开始富集，而GZMK+效应细胞只在UC结肠细胞中富集。很少有IL23R+细胞（主要包括IL26+，一些MAIT和DP细胞）对PMA+ionomycin刺激作出反应，符合其转录的“后效应子”终末分化特征。IL-17在UC IL23R+/IL26+细胞中低表达，但UC CD8+细胞的激活能诱导IL-17在缺失IL23R但TNF-α/IFN-γ阳性的亚群中表达。

6.人源化小鼠模型中，人IL-26的表达可缓解DSS诱导的结肠炎，IL-26抗体处理可逆转

利用DSS处理小鼠，相比野生型小鼠，用对照单抗处理过的hIL-26Tg小鼠的炎症指标显著降低，而用IL-26单抗处理可使炎症指标回升，暗示IL-26在急性炎症反应中具有保护作用。对小鼠的健康结肠组织和经DSS处理过的结肠组织进行RNA-seq，GO富集分析表明野生小鼠中与T细胞和B细胞活化以及白细胞增殖相关的基因富集，而Tg小鼠中富集程度明显降低，说明即使在非炎性条件下，IL26也能降低粘膜的免疫浸润或下调激活和增殖信号。经DSS处理过的小鼠中，炎症信号分子在hIL-26小鼠中显著下调。