酵母双杂交筛选互作蛋白流程

日期：2023-05-29 16:31:20

酵母双杂交技术是一种常用的蛋白质互作筛选方法，通过利用酵母中的转录因子结合域（BD）和激活域（AD）相互作用来检测目标蛋白在细胞内是否存在互作关系。这项技术可以用于从大量的蛋白质库中筛选出与已知蛋白质相互作用的候选分子。下面将介绍酵母双杂交筛选互作蛋白的流程。

一、克隆两个DNA片段

首先需克隆两个DNA片段：一个用于编码转录因子结合域BD，另一个用于编码激活域AD。这两个DNA片段需分别克隆到不同的表达载体中。其中，BD和AD的序列应该很短，这有助于减少错配结合和非特异性激活的可能性。此外，在选择BD和AD的序列时要避免它们之间的重叠区。BD和AD序列应该还需要经过验证，以确保它们不对细胞造成毒性影响。

二、将两个表达载体引入酵母细胞

将BD载体和AD载体分别转化到酵母细胞中，然后进行培养。要确保转化效率、酵母细胞健康状态和表达载体的稳定性。

三、筛选蛋白质相互作用

将需要筛选的蛋白质库与转化后的酵母菌涂在含有选择素的富含糖的平板上。这些平板上的细胞将生长出许多小白色斑点，这些斑点代表可能存在蛋白质互作的情况。待这些小斑点变大之后，将它们收集到小管中，并进行PCR扩增，以确定它们的DNA序列。可在获得的DNA序列数据库中搜索匹配的蛋白资料库，查看其是否已知与目标蛋白有互作关系。

此外，在酵母双杂交中还需注意以下事项：

1、转化后的酵母细胞应该是健康状态的，并且表达载体应该是稳定的。

2、选择合适的蛋白质库，以确保它包含感兴趣的蛋白质。通常，可以采用人类或其它模式生物的基因库。

3、在初始筛选时，应该使用严格的选择条件，以排除非特异性的互作。

4、在一些情况下，可以采用一些辅助技术，如蓝/白斑点法和X-gal染色法，以提高筛选的灵敏度和特异性。

酵母双杂交技术是一种常用的蛋白质互作筛选方法，可以从大量的蛋白质库中筛选出与已知蛋白质相互作用的候选分子。在进行这项技术时，需要注意一些注意事项，并严格按照实验流程进行操作。