好物好推荐：内参抗体！

日期：2018-11-28 10:10:48

内参抗体

内参即内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。

在Western Blot实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。

此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。

常用的细胞总蛋白质内参有GAPDH和细胞骨架蛋白β-Actin或β-Tubulin等。对于一些植物的样本，则需要特别的植物Actin蛋白作为内参。当实验样品中只是核蛋白，而不是细胞总蛋白提取液时，可以用组蛋白H（Histone H），或者增殖细胞核抗原（PCNA）等为核内参抗体。而在一些特别的针对线粒体作为微环境的研究课题时，则需要提取线粒体总蛋白并检测其中的目标蛋白含量，常用COX IV或VDAC1作为内参抗体。

在选择内参时，需要综合考虑待检蛋白的分子量大小以及在细胞中的位置，内参与检测的目的蛋白的分子量应相差5kDa以上。

常见的内参抗体：

1）GAPDH内参抗体

GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。 GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，可广泛用作Western Blot蛋白质标准化的内参。

※不适合用于检测30kDa-40kDa大小目标蛋白的WB实验中。在某些细胞中，由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达增高，也不适合做内参。

2）β-Actin内参抗体

Actin即肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白。Actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，其余两种广泛分布于各种组织中，包括 β-actin和γ-non-muscle actin。β-actin作为内参是得到了公认的，这是针对大多数组织和细胞来说的，它广泛分布于细胞浆内，表达量非常丰富，其含量占所有细胞总蛋白的50%。但是在一些少量特殊的情况下，如脂肪组织或细胞内，β-Actin的表达量就很少。β-actin由375个氨基酸组成，分子量大小为42-43kDa左右。

※适合用于检测38kDa-48kDa大小目标蛋白的WB实验中。在脂肪组织里，β-Actin的表达量非常低，不适合作为内参。

3）β-Tubulin抗体

Tubulin即微管蛋白，是细胞的一种骨架蛋白。Tubulin分为α、β、γ、δ、ε等多种tubulin，其中α-Tubulin和β-Tubulin可以形成异源二聚体，是形成微管的最主要的两种Tubulin。α-tubulin和β-tubulin分子量分别为55kDa和50kDa，其实际检测条带均在55kDa左右。作为内参，β-tubulin的蛋白水平通常不会发生改变，因此被广泛用于Western Blotting时上样量是否一致的参照，也常被用于免疫染色观察细胞的微管结构。

※不适合用于检测50kDa-60kDa大小目标蛋白的WB实验中。在脂肪组织或细胞内，β-Actin的表达量很少，不适合做内参。

Tips: 内参的选择还需考虑实际的实验环境：

★在做多组织多细胞样本对比表达量时，最好选用GAPDH作为内参，因为GAPDH是代谢类蛋白，在活组织中表达比较恒定。而β-Actin和β-Tubulin是结构蛋白，不同组织的细胞结构会有差异性。

★做诱导后样本或检测磷酸化等修饰性抗体时，应选择结构蛋白作为内参，如β-Actin 和β-Tubulin。

★设计实验方案的时候应该考虑实际的实验因素并查询相应文献，在实验过程中也应该注意内参表达是否出现异常。

★做 Western Blot实验时，内参的条带强度也要适当控制。不要让内参条带发生过度曝光的情况，尤其是用 X 胶片曝光的。如果内参条带过度曝光，条带会显得很宽，妨碍对条带正确强度的判读，进而影响对其他实验结果的判断。最好的内参结果是：窄窄的，黑色实心条带。