&#4326；WB之成功全攻略&#4326；

何为蛋白印迹（WB）

蛋白印迹也称作免疫印迹，是一种被广泛应用并得到公认的技术，用于检测细胞或组织提取物中的蛋白表达水平。
这一技术利用抗体与特定待检测蛋白的结合，测定生物样本中的蛋白水平。抗体与其靶点蛋白表位的精确结合可用于检测蛋白质中具有高度特异性的氨基酸序列。
一句话讲完WB：就是抗原抗体反应！

Western Blot 可以：
1.从蛋白质混合物中检出目标蛋白质；
2.定量或定性确定细胞或组织中蛋白质的表达情况；
3.用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用后续分析。

▲WB操作关键步骤

以下，会从关键步骤入手，我们将给出试剂和实验过程的建议，逐一介绍每个步骤中的一些关键注意点以及给出对应优化后的图表，供大家参考

一、裂解产物制备
1.组织裂解
常见破碎组织的方法： 机械法、匀浆法、超声波破碎解、研磨法，反复冻融法等；
实验室常用的破碎方法：
1.超声波；
2.电动研磨；
3.磁珠破碎法。（注意磁珠高速旋转时产生的热量比较多，需提前把机器放在冰箱制冷）
以上主要注意发热引起的蛋白变性和聚集，操作过程中尽量减少细节上的差异，这样才能保证实验结果的重复性比较一致。

2.细胞裂解
一般裂解液包含以下几个组分:
1. 缓冲系统；
2. 盐离子；
3. 离液剂；
4. 蛋白酶抑制剂；
5. 还原剂

▲根据目的蛋白选择合适的裂解液 

▲常见蛋白酶磷酸酶抑制剂

二、凝胶电泳
1.加入足量的样品和分子量大小标记物
SDS-PAGE 根据蛋白电泳迁移率将其分离，迁移率是蛋白大小和电荷的函数。
我们建议在预制 Tris-Glycine 小孔胶上样20-40μg 全细胞裂解液或100ng纯化蛋白，根据目标蛋白的表达量优化上样量。
对于大分子量靶标，我们建议采用 Tris-Acetate 凝胶和相关缓冲液。
应在待测样本附近的泳道始终加入分子量标记物，作为参考点。
分子量标记物（或梯状条带）是已知分子量的纯化蛋白的混合物。
采用预染色标记可以看见电泳过程中蛋白迁移的距离，随后确认经电转移至膜。
采用生物素标记物可以看见膜上的梯状条带和抗体靶标。

2.选择合适的蛋白marker
预染蛋白marker应用：
➽实时监控SDA-PAGE中的蛋白迁移
➽检验western转膜效率
➽对蛋白大小进行初略鉴定
➽呈彩色且转膜效果好

▲电泳凝胶制备参考浓度

三、转膜
1.湿转移
把蛋白从凝胶转移至膜上的湿转移是指把滤纸-凝胶-膜-滤纸“三明治”完全浸入缓冲液中。使用此方法时，在浸没的情况下通过电泳转移至 0.2 μm 孔径硝酸纤维素膜，在冷却的含 20% 甲醇的转移缓冲液中转膜，70V，1.5小时。

2.半干转移
把蛋白从凝胶转移至膜上的半干转移是指将浸满缓冲液的滤纸-凝胶-膜-滤纸“三明治”系统，置于本应干燥的阳极和阴极板上。
在这一系统中，转移在桌面上进行，在室温条件下约15-60分钟。转移低分子量和高分子量蛋白时这一系统均运转良好，相较于湿转移所需缓冲液更少，但是在某些情况下会产生更高的背景染色。（转膜时不离人，监测电流电压）

3.干转移
把蛋白从凝胶转移至膜的干转移是指不额外加入缓冲液的系统，因为阳极和阴极板系统中含有缓冲液基质。对于较大分子量蛋白，观察到信号差异最大，表明转移效率低。
（注意：在样本量有限或待检测蛋白低内源水平的情况下，干转移方法会限制您分析的灵敏度。）

▲Trans Blot

四、封闭
建议转移之后迅速在 Tris-Buffered Saline (TBS) 中洗涤膜，以便移除残留的转移缓冲液，随后在室温条件下含5% 脱脂牛奶的 Tris Buffered Saline 和 Tween® 20 去污剂 (TBST)中封闭1小时。这一封闭步骤有助于降低非特异性一抗结合并降低背景。应避免膜封闭时间过长，因为这会掩盖抗原表位，阻止抗体结合。封闭后在TBST 中洗涤5分钟。

五、一抗、二抗孵育
1.加一抗与抗原结合
➥一抗应在含5% BSA 或5% 脱脂牛奶的 TBST 缓冲液中稀释。
➥一抗孵育时间会有很大的差别，具体取决于研究人员采用的操作流程。建议在4℃ 过夜孵育一抗。（过夜孵育提高抗体结合）
➥免疫印迹操作流程的另一个存在差异的方面是洗涤和稀释缓冲液。推荐抗体稀释缓冲液和洗涤步骤使用TBST。(TBST 缓冲液产生更强的信号)

2.加二抗与一抗的结合
➥建议在含 5% 脱脂牛奶的 TBST 中稀释二抗。
➥因为脱脂牛奶的封闭要更强，所以基于 BSA 的稀释比基于牛奶的稀释产生的背景明显更强。
➥如果对免疫沉淀细胞裂解物进行免疫印迹实验，考虑采用构象或链特异性二抗，以避免 IgG 重链或轻链的信号。

这个步骤的成败
关键看试剂质量的好坏
用的抗体不到位
整个实验都白费
有木有

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六、检测
一般使用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法或碱性磷酸酶AP-NBT/BICP显色法。
1．HRP-ECL发光法：
将A、B发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5min左右）后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。

2．AP-NBT/BICP显色法：
每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前将一片分装在30个 EP管中，每张3×9cm的膜取一管配成1ml即可。将PBST或TTBS洗涤过的膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物体（如报纸）遮挡光线，显色20s后每10s观察一次，至条带明显或有本底出现时将膜揭起置去离子水中漂洗后放滤纸上晾干即可观察与扫描。背景深浅与一抗的质量及二抗的量有关，当然如果曝光时间长达半小时，出现背景是正常的。

▲显色
（干货是不是很受用）
还想了解更多么
敬请期待~
下次为大家带来
WB中的常见问题及解答
明明白白做实验
善其事前利其器
普通问题常规避
优化成功没问题
 

（如若有实验中需要了解的问题，欢迎留言哦）
下次干货一起为您奉上

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