大肠杆菌蛋白表达实验流程

日期：2023-06-06 13:27:15

大肠杆菌（Escherichia coli）常被用于蛋白表达实验，因为其易于培养、生长速度快且产量高。本文将介绍一个常见的大肠杆菌蛋白表达实验的流程。

一、基因克隆

1、选择适当的质粒载体

质粒DNA是一个小型的环形分子，在基因工程中被广泛应用。选择一个适当的质粒载体对于蛋白表达非常重要。一般而言，常见的质粒载体有pET系列、pGEX系列等。根据需要选择含有不同诱导子和选择标记的质粒载体。

大肠杆菌蛋白表达

2、目的基因扩增

将目的基因扩增后，将其接入到质粒载体的多克隆位点上。这一步可以通过PCR方法来进行扩增，也可以通过化学合成的方式获取到序列完整、长度合适的基因片段。同时，在PCR扩增过程中，应考虑到靶基因的大小和构建的质粒载体的限制酶切位点的配对问题。

3、活性测定

在将目的基因接到质粒载体后，可进行限制性酶切鉴定、DNA测序鉴定等活性测定，以确定目的基因序列是否正确。

二、转化

将质粒载体转化入大肠杆菌中，使其在细菌内表达。转化方法有化学转化法、电转化法和热激转化法等。

三、筛选阳性克隆株

转化后需要对大肠杆菌进行筛选。常用的方法是在含有抗生素的LB平板上筛选，含有适合质粒载体选择标记的抗生素。

四、蛋白表达

1、预培养

将大肠杆菌阳性克隆株接入到LB培养基中预培养，通常为37℃、200-250rpm振荡培养。

2、诱导表达

当大肠杆菌发展到指定的OD600值时，添加诱导剂进行表达。在此过程中应选择合适的诱导浓度和时间，不同的质粒载体可能对诱导剂的反应存在差异。

3、加入辅酶

辅酶对于某些蛋白质表达至关重要。如在pET质粒中，可以添加辅酶T7。

4、分析蛋白表达

通过采集样品、离心、液氮冻存等方法来分析蛋白表达的情况，如采用SDS-PAGE技术进行蛋白质分离，并采用Western blotting技术进行检测。

五、提取纯化

1、细胞破碎

为了提取表达的蛋白质，需要对细胞进行破碎。一般使用化学破碎法、超声波法、高压法等方法将细胞破碎。

2、纯化

破碎后的混合物中含有多种蛋白质和其他杂质，需要进行纯化。常见的纯化方法有亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。

通过以上流程，大肠杆菌中的目的基因可以得到表达，并且通过适当的纯化方法，可以提取高纯度的目的蛋白质。