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泛素化酵母双杂交原理

日期：2023-06-29 17:03:48

    泛素化酵母双杂交（ubiquitin-based yeast two-hybrid，UB-TH）是用于检测蛋白质相互作用的实验方法。它基于酵母细胞中的蛋白质泛素化机制和双杂交原理。
 
    泛素化是指将泛素分子共价地附着到其他蛋白质上的过程。在UB-TH实验中，目标是研究一个蛋白质与另一个蛋白质的相互作用。为了进行这个实验，如下步骤被执行：
 
    构建酵母表达载体：首先，目标蛋白质的编码序列被克隆到一个表达泛素结构域的载体中。该载体还包含可以激活或抑制基因转录的报告基因。
 
    构建酵母融合表达载体库：其次，构建一个酵母表达多肽库，其中每个多肽都与一个蛋白质编码序列连接。这些多肽通常是来自一个复杂的生物样品，如组织提取物或cDNA文库。
 
    HTDNA（High-throughput DNA）双杂交筛选：然后，将目标蛋白质表达载体与融合表达载体库一起转化到酵母细胞中。如果目标蛋白质与库中的任何一个融合蛋白质发生相互作用，目标蛋白质的泛素结构域将被泛素化。这导致目标蛋白质与报告基因的转录激活或抑制，从而产生可测量的荧光或生长。
 
    验证相互作用：通过进一步验证，确认在双杂交筛选中检测到的相互作用是否真实有效。常见的验证方法包括重复酵母双杂交、共沉淀实验等。
 
    通过UB-TH原理，可以鉴定和分析蛋白质相互作用网络，进而理解细胞中的信号传递和调节机制。它在功能基因组学和药物研发等领域中得到了广泛应用。