毕赤酵母表达系统操作应用指南

日期：2023-05-25 14:39:48

一、实验前准备

1、毕赤酵母菌株选用
根据目标表达蛋白的种类和性质，选择适合的毕赤酵母菌株，例如X-33、GS115等菌株。

2、选择表达载体
根据需要选择不同的表达载体，常用的有pPICZ、pPIC9、pGAPZ等载体。

3、选择启动子和信号肽
根据表达蛋白的种类和性质，选择适合的启动子和信号肽。常用的启动子有AOX1、GAP等，常用的信号肽有α-factor、Kex2等。

4、设计引物合成模板并克隆
根据目标序列设计引物并克隆到表达载体中，通常采用PCR扩增目标序列并构建重组载体。进行克隆前，应该检查引物序列是否正确，并选择适合的限制酶进行酶切。

5、菌种接种培养
取出冷冻保存的毕赤酵母菌株，接种在YPD固体培养基上，进行单克隆筛选和扩增。选用单克隆菌株接种到液体培养基中进行大量扩增，用于后续实验。

6、培养基制备
准备适合的表达培养基，通常采用BMGY培养基进行前期培养，采用BMMY培养基进行表达。

7、质粒提取
在进行重组毕赤酵母工程表达前，需要将表达载体从大肠杆菌中提取并纯化。

二、重组毕赤酵母工程的表达

1、初筛
将酵母菌株接种到BMGY液体培养基中，进行预培养。然后将菌株移植到BMMY液体培养基中，使其进入诱导表达阶段。通过测定菌株OD值和表达蛋白的分子量，初步筛选出表达较好的菌株。

2、优化条件
根据初筛结果，调整表达条件，包括温度、pH值、诱导时间、诱导剂浓度等参数进行优化，以获得最佳的表达效果。

3、收获表达产物
收获表达过的毕赤酵母菌株，加入混合物中（如裂解缓冲液），使其发生破裂并释放出表达产物。通过离心等方式，收集沉淀物或上清液，提取表达产物并进行纯化。

4、验证表达产物
对得到的表达产物进行质谱鉴定、SDS-PAGE凝胶电泳等检验手段进行验证，检测表达产物的分子量和纯度，并对其进行功能分析。

三、实验注意事项

在操作前应该全面了解毕赤酵母菌株的生长和表达特点，以及各种培养基和表达载体的优缺点。

1、在接种前，应该预先进行酵母菌株的检测和鉴定，确保它们的纯度和活性。

2、在诱导表达过程中，一定要严格控制条件和参数，避免对表达效果产生不良影响。

3、表达产物收获后，应及时进行纯化和验证，以保证获得高品质的表达产物。

4、操作过程中，应该注意实验材料的无菌操作，使用优质的试剂和耗材，避免对实验结果产生影响。

四、实验总结

毕赤酵母表达系统是一种可靠和高效的重组蛋白表达方法。在实验过程中，需要充分了解毕赤酵母的生长和表达特性，合理选择表达载体和启动子，并进行优化条件，以获得高品质的表达产物。同时，在操作过程中，应该注意实验材料的无菌操作，使用优质的试剂和耗材，避免对实验结果产生影响。